Indagini molecolari

Le indagini molecolari consistono nello studio delle componenti molecolari fondamentali degli organismi viventi, in particolare del DNA e dei suoi derivati (RNA e proteine), mediante moderne metodiche che consentono di isolare, caratterizzare e manipolare gli acidi nucleici, molecole che forniscono importanti informazioni relative non solo al singolo organismo ma anche alla storia evolutiva delle specie. Il DNA e le proteine possono essere, infatti, paragonati a documenti storici e dalla somiglianza riscontrata tra queste molecole si possono desumere le relazioni di parentela tra gli organismi. In tal senso è molto importante anche lo studio del DNA antico (aDNA) cioè del materiale genetico residuo che si può estrarre dopo la morte da materiali biologici, quali ossa, denti, resti mummificati di animali o vegetali e fossili.
Il DNA può essere estratto da un campione biologico con l’ausilio di adeguate soluzioni e solventi organici (quali fenolo, cloroformio, etere) che consentano di separare tale molecola, carica negativamente per la presenza dei residui di fosfato, dalle altre componenti cellulari. Il DNA ottenuto può poi essere utilizzato in differenti analisi quali reazione a catena della polimerasi (PCR), elettroforesi su gel, clonaggio, sequenziamento, Southern, Northern e Western blot.
La PCR è una tecnica che prevede l’amplificazione di una sequenza di DNA fino ad ottenerne milioni di copie; essa consiste in una reazione enzimatica che amplifica in vitro una specifica regione del DNA, utilizzando piccole quantità di DNA come materiale di partenza. Essa prevede una serie di cicli composti da tre fasi: nella prima (denaturazione) ad alte temperature si ha la separazione della doppia elica di DNA; nella seconda (annealing) specifici inneschi si appaiano a precisi tratti del singolo filamento di DNA; nella terza (polimerizzazione) l’enzima
TAQ polimerasi, usando come stampo la sequenza, sintetizza un nuovo filamento di DNA.
L’elettroforesi su gel permette di separare frammenti di acido nucleico, in funzione del loro peso molecolare; tali frammenti, infatti, essendo carichi negativamente, quando vengono posti in un campo elettrico, tendono ad andare verso il polo positivo, e più sono grandi e pesanti, più lentamente migrano rispetto ai frammenti più piccoli. La visualizzazione dei frammenti avviene grazie a sostanze intercalanti (tra le quali il bromuro di etidio) che esposte ai raggi UV risultano fluorescenti. L’uso di un marcatore con frammenti di dimensione nota, permette di valutare, per confronto, le dimensioni dei frammenti esaminati.
Nel clonaggio molecolare una specifica sequenza di DNA viene inserita in un opportuno vettore allo scopo di ottenerne numerose copie attraverso l’amplificazione di cloni delle cellule in cui tale vettore è stato inserito.
La determinazione della sequenza con cui i vari nucleotidi si susseguono in una molecola di DNA può essere effettuata mediante analisi manuale o grazie all’ausilio di sequenziatori automatici di recente generazione.
Le analisi di Southern e Northern blot sfruttano la separazione dei frammenti di acido nucleico (DNA nel Southern ed RNA nel Northern) in gel elettroforesi ed il successivo trasferimento dal gel su una membrana. L’acido nucleico è poi ibridato con una sonda marcata che evidenzia il DNA o l’RNA di interesse. La tecnica del Southern infatti è utilizzata per rilevare la presenza di specifiche sequenze di DNA, mentre quella del Northern viene utilizzata per valutare i livelli di espressione dell’RNA messaggero di un gene.
Nel Western blot viene valutato il livello di espressione di una proteina. Similmente al Northern e al Southern, si effettua prima una elettroforesi denaturante per far separare le varie proteine in funzione della massa molecolare, annullando le cariche degli amminoacidi che influenzerebbero la migrazione.
Le proteine poi vengono visualizzate attraverso anticorpi sintetizzati per la proteina di interesse.

Bibliografia:
BONCINELLI E., SIMEONE A., 1991. Ingegneria genetica, Idelson, pp.371.
WATSON J., 2005. Biologia molecolare del gene, Zanichelli, pp. 720.

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